La mancha Gram es un método diferencial de tinción utilizado para asignar bacterias a uno de dos grupos (gram-positivo y gramnegativo) en función de las propiedades de sus paredes celulares. También se conoce como tinción de Gram o método de Gram & amp; apos; s. El procedimiento lleva el nombre de la persona que desarrolló la técnica, el bacteriólogo danés Hans Christian Gram.
Cómo funciona la mancha de Gram
El procedimiento se basa en la reacción entre peptidoglicano en las paredes celulares de algunas bacterias. La mancha Gram implica manchar bacterias, fijar el color con un mordaz, decolorar las células y aplicar una contramancha.
Video destacado
- La mancha primaria (violeta cristalina) se une al peptidoglucano, coloreando las células de color púrpura. Tanto las células grampositivas como las gramnegativas tienen peptidoglucano en las paredes celulares, por lo que inicialmente todas las bacterias manchan violeta.
- El yodo Gram & amp; apos; s (yodo y yoduro de potasio) se aplica como mordaz o fijador. Las células grampositivas forman un complejo cristalino violeta-yodo.
- El alcohol o la acetona se usan para decolorar las células. Las bacterias gramnegativas tienen mucho menos peptidoglucano en las paredes celulares, por lo que este paso esencialmente las hace incoloras, mientras que solo parte del color se elimina de las células grampositivas, que tienen más peptidoglucano (60-90% de la pared celular). La pared celular gruesa de las células grampositivas se deshidrata por el escalón decolorante, lo que hace que se encojan y atrapen el complejo de yodo manchado en el interior.
- Después de la etapa de decoloración, se aplica una contraestatina (generalmente safranina, pero a veces fucsina) para colorear las bacterias de color rosa. Tanto las bacterias grampositivas como las gramnegativas recogen la mancha rosa, pero no es visible sobre el púrpura más oscuro de las bacterias grampositivas. Si el procedimiento de tinción se realiza correctamente, las bacterias grampositivas serán de color púrpura, mientras que las bacterias gramnegativas serán de color rosa.
Propósito de la técnica de tinción de Gram
Los resultados de la mancha Gram se ven mediante microscopía de luz. Debido a que las bacterias son de color, no solo se identifica su grupo de manchas Gram, sino que se puede observar su forma, tamaño y patrón de aglomeración. Esto hace que la mancha Gram sea una valiosa herramienta de diagnóstico para una clínica médica o laboratorio. Si bien la mancha puede no identificar definitivamente las bacterias, a menudo saber si son grampositivas o gramnegativas es suficiente para recetar un antibiótico efectivo.
Limitaciones de la técnica
Algunas bacterias pueden ser gram-variables o gram-indeterminadas. Sin embargo, incluso esta información puede ser útil para reducir la identidad bacteriana. La técnica es más confiable cuando los cultivos tienen menos de 24 horas. Si bien se puede usar en cultivos de caldo, es mejor centrifugarlos primero. La limitación principal de la técnica es que produce resultados erróneos si se cometen errores en la técnica. Se necesita práctica y habilidad para producir un resultado confiable. Además, un agente infeccioso puede no ser bacteriano. Los patógenos eucariotas manchan el gramnegativo. Sin embargo, la mayoría de las células eucariotas, excepto los hongos (incluida la levadura), no se adhieren al portaobjetos durante el proceso.
Procedimiento de tinción de Gram
Materiales
- Violeta cristalina (mancha primaria)
- Gram & amp; apos; s yodo (mordante, para fijar el cristal violeta en la pared celular)
- Etanol o acetona (decolorizador)
- Safranina (mancha secundaria o contramancha)
- Agua en una botella de agua o botella cuentagotas
- Microscopio portaobjetos
- Microscopio compuesto
Pasos
- Coloque una pequeña gota de muestra bacteriana en un portaobjetos. El calor fija la bacteria al portaobjetos pasándola a través de la llama de un mechero Bunsen tres veces. Aplicar demasiado calor o durante demasiado tiempo puede derretir las bacterias y las paredes de las células, lo que distorsiona su forma y conduce a un resultado inexacto. Si se aplica muy poco calor, la bacteria se lavará del portaobjetos durante la tinción.
- Use un gotero para aplicar la mancha primaria (violeta de cristal) al portaobjetos y permita que se quede sentado durante 1 minuto. Enjuague suavemente el portaobjetos con agua no más de 5 segundos para eliminar el exceso de mancha. Enjuagar demasiado tiempo puede eliminar demasiado color, mientras que no enjuagar lo suficiente puede permitir que quede demasiada mancha en las células gramnegativas.
- Use un gotero para aplicar el yodo Gram & amp; apos; s al portaobjetos para fijar el violeta de cristal a la pared celular. Déjalo reposar durante 1 minuto.
- Enjuague el portaobjetos con alcohol o acetona durante unos 3 segundos, seguido inmediatamente con un enjuague suave con agua. Las células gramnegativas perderán color, mientras que las células grampositivas seguirán siendo violetas o azules. Sin embargo, si el decolorador se deja demasiado tiempo, todas las celdas perderán color!
- Aplique la mancha secundaria, la safranina y permita que se siente durante 1 minuto. Enjuague suavemente con agua no más de 5 segundos. Las células gramnegativas deben estar manchadas de rojo o rosa, mientras que las células grampositivas seguirán apareciendo de púrpura o azul.
- Vea el portaobjetos con un microscopio compuesto. Puede ser necesario un aumento de 500x a 1000x para distinguir la forma y disposición de la célula.
Ejemplos de patógenos Gram-positivos y Gram-negativos
No todas las bacterias identificadas por la mancha Gram están asociadas con enfermedades, pero algunos ejemplos importantes incluyen:
- Cocci & amp; amp; nbsp; Gramático; (redondo): Staphylococcus aureus
- Cocos gramnegativos: & amp; amp; nbsp; Neisseria meningitidis
- Bacilos grampositivos (barras): & amp; amp; nbsp; Bacillus anthracis
- Bacilos gramnegativos: & amp; amp; nbsp; Escherichia coli
& amp; # x203A; Ciencias
